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Kit para recolha de amostras de fluidos orais

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Kit para recolha de amostras de fluidos orais

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Durante estes últimos anos, foram sendo desenvolvidas e validadas novas ferramentas de amostragem, monitorização e diagnóstico em porcos que sejam mais rápidas, simples e menos onerosas.

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    Uma destas técnicas é a recolha e uso de fluídos orais (saliva) como espécime para diagnóstico em porcos. Esta técnica já foi validada experimentalmente para PRRSV, PCV2 e Gripe e está a ser utilizada de forma rotineira nos sistemas produtivos nos EUA, para a detecção PRRSV e Gripe a nível populacional. De uma maneira geral, a técnica baseia-se em suspender uma corda de algodão num curral para ser mordida pelos porcos, que depositam aí a sua saliva (Prickett et al. 2008).

    Do kit constam os seguintes elementos:

    • Corda de algodão 100% (não tratada com produtos químicos);
    • Saco de plástico (tipo Zipplog ®);
    • Tubo de plástico estéril com base cónica ou arredondada e com capacidade suficiente para o volume da amostra;
    • Par de luvas de latex.

     

    1. Pontos chave:

    • O número de cordas necessário para a amostragem ser representativa dependerá do tamanho da população, da distribuição dos pavilhões e do tamanho dos currais (considera-se que nos pavilhões de 1000 animais, 6 cordas são suficientes para detectar 10% de prevalência com 95% de confiança (Detmer et al., 2010).
    • O diâmetro da corda e a altura a que deve ser colocada dependerá da idade dos animais, mas deve ser de fácil acesso para todo o grupo.
    • Um periodo de tempo de 30 min é suficiente para que 75% dos animais contactem com a corda num curral de 25-30 animais, aumentando até 90% se, durante o mesmo tempo, as cordas forem suspensas.
    • Antes da recolha, verificar se a corda está saturada de saliva (vai ajudar a determinar se o tempo foi ou não suficiente).

    2. Recolha da amostra:

    Corta-se a parte húmida da corda e deposita-se no saco de plástico limpo. É extraída a saliva, como mostram as imagens e decantada nos tubos estéreis.

    Precauções: A extracção da saliva deve ser realizada com a maior brevidade possível após a recolha das cordas e procurando manipular o menos possível a corda directamente com as mãos para evitar contaminações cruzadas. Refrigerar as amostras rapidamente.

    Amostras de fluído oral

    3. Conservação:

    - A sujidade das amostras (artefactos) pode interferir no resultado do diagnóstico. Por isso, a saliva tem que ser centrifugada (1000-2000 rpm/30 min.) ou, pelo menos, permitir durante 60 min. que as partículas de sujidade presentes na amostra se depositem no fundo do tubo. Proceder à análise ou conservação do sobrenadante.

    - As amostras devem ser mantidas em refrigeração (4-10°C). A 4°C podem ser mantidas até 12 dias sem ser alterada a detecção de PRRSV mediante PCR. Para a sua conservação as amostras devem ser congeladas (-20°C ou -80°C).

    4. Análise:

    A detecção agentes patogénicos virais e bacterianos é realizada por Reacção em Cadeia da Polimerase (PCR). O RNA viral de PRRS e da Gripe podem ser detectados na saliva às 24 h. A detecção de anticorpos frente a PRRSV e PCV2 pode ser realizada por teste de ELISA e contitui uma alternativa ao PCR para diminuir custos de diagnóstico. No entanto, o isolamento viral de PRRSV e PCV2 ainda nãe é realizado e, no caso da Gripe, a percentagem de isolamento a partir de fluídos orais PCR positivos é de 51%.

    5. Vantagens e limitações da técnica:

    A monitorização de uma população através de fluídos orais pode resultar num menor custo em diagnóstico ao mesmo tempo que se aumenta o número de porcos amostrados e num futuro, os agentes patogénicos que podem ser detectados.

    A recolha de amostras não requer pessoal especializado, além de que a natureza curiosa dos porcos facilita a amostragem, uma vez que interagem e brincam com a corda enquanto depositam nela a sua saliva.

    Com as amostras de fluídos orais conseguimos uma maior representatividade da população e a sensibilidade para detectar infecções de baia prevalência (≤10%) é igual ou superior às tradicionais 30 amostras individuais.

    As amostras de fluídos orais são representativas a nível de população, mas nunca podem substituir as amostras individuais para o isolamento de um microorganismo.

    É muito importante, para evitar falsos negativos, fazer pools de amostras e certificar-se que as amostras são processadas num laboratório familiarizado com as técnicas de diagnóstico em saliva.

    Para mais informação consultar:

    http://vetmed.iastate.edu/vdpam/disease-topics/oral-fluids
    http://www.vdl.umn.edu/submission-guidelines/oral-fluids/index.htm

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